帶你全面了解ADC
前言
抗體偶聯藥物(ADC)是由靶向特異性抗原的單克隆抗體與小分子細胞毒性藥物通過連接子鏈接而成,兼具傳統(tǒng)小分子化療的強大殺傷效應及抗體藥物的腫瘤靶向性。ADC由三個主要部分組成：負責選擇性識別癌細胞表面抗原的抗體，負責殺死癌細胞的藥物有效載荷，以及連接抗體和有效載荷的連接子。
ADC對抗原的識別導致ADC通過內吞途徑進入細胞內，通過溶酶體降解后，有效載荷以生物活性形式釋放并發(fā)揮作用，導致癌細胞死亡。細胞內有效載荷的數量由每個細胞表面抗原的數量、每個ADC的藥物有效載荷分子的數量（也稱為藥物抗體比率，DAR）以及抗原返回細胞表面所需的時間決定。有效載荷可能在癌細胞死亡和降解后逃逸，也可能從胞漿中透膜而出。這種釋放的后果可能是有益的（也稱為旁觀者效應），也可能是有害的，導致全身毒性。
2009年gemtuzumab ozogamicin（Mylotarg) 是美國食品和藥物管理局（FDA）批準的第一個ADC藥物。目前，FDA已經批準上市了14個ADC藥物，還有上百個ADC藥物正處于臨床研究階段。
2009年，卡利霉素、金盞花素和美登素類藥物是用于ADC開發(fā)的主要細胞毒素。十年來，這些分子仍然被用作有效載荷進行優(yōu)化，以獲得更好的穩(wěn)定性和親水性。新的細胞毒性物質也被開發(fā)出來，如PBDs、杜卡霉素和喜樹堿衍生物等。
抗體工程在10年間也已經取得了相當大的進展，允許更多的位點特異性偶聯，提高了ADC的均一性和穩(wěn)定性。新的第二代和第三代ADC已經進入臨床，以期獲得更好的治療效果和安全性。幾十種基于半胱氨酸殘基、非天然氨基酸或分子工程模式的生物偶聯技術也已經在臨床前研究獲得了驗證。此外，更多的腫瘤特異性抗原靶點和腫瘤內細胞毒性藥物的釋放機制使ADC獲得了爆炸式的發(fā)展，ADC藥物進入了黃金時代。
ADC的有效載荷
1. 微管破壞藥物
金盞花素
Auristatins是ADC中使用的重要有效載荷，最著名的家族成員MMAE存在于兩種上市藥物Adcetris和Polivy中。目前，超過10種以金盞花素（如MMAE）或一甲基金盞花素F（MMAF）為有效載荷的ADC正在進行臨床試驗。
上圖描述了auristatine及其常用的連接位點。金盞花素的構效關系（SAR）已被廣泛研究，主要集中在末端亞單位：P1（N-末端）和P5（C-末端），最常見的方法是在P1上引入氨基甲酸酯功能。
2015年，西雅圖遺傳學的研究人員將ADC有效載荷的范圍擴大到包括叔胺，特別是N-二甲基auristatine，首次通過銨鍵將藥物與單克隆抗體結合。所得ADCs在生理條件下穩(wěn)定，體內外活性高，免疫特異性強。這些結果擴大了ADC可用于靶向給藥的藥物種類。
最近，Agensys公司通過調節(jié)中心亞基P2-P3-P4，將疊氮化物基團引入P2和P4亞基，在與蛋白酶可裂解的連接子偶聯后，產生了在體外和體內效力提高的親水性衍生物，這為連接子的連接提供了新途徑。
一般來說，在同時含有胺和醇反應的auristatin中，首選的連接點是胺通過氨基甲酸酯鍵偶聯。西雅圖遺傳學開發(fā)了一種新的策略，將含醇的有效載荷與亞甲基烷氧基氨基甲酸酯（MAC）偶聯。為了穩(wěn)定MAC鍵，堿性基團和吸電子基團都靠近氨基鍵，結果表明，該偶聯物在生理條件下是穩(wěn)定的，具有很高的效價，并且在體內外都具有免疫特異性。
此外，烏普薩拉大學的研究人員還開發(fā)了AZASTATIN，作為一類新的強有力的auristatin衍生物，包含一個中心胺側鏈的抗體結合位點。他們的研究結果證實，這些auristatin衍生物是一類新的細胞毒性有效載荷，適合ADC開發(fā)。
美登素衍生物（DM2，DM4）
美坦辛是一種非常有效的微管組裝抑制劑，可誘導細胞的有絲分裂停止。但是這種結構很難共軛，因為它沒有反應性官能團，為了克服這個問題，一系列含有SMe基團的非常有效的衍生物被創(chuàng)造出來。這一類分子的第一個例子是DM1和DM4，它們帶有甲硫丙�；皇翘烊籒-乙酰基。
從有效載荷DM1和DM4中，通過使用二硫鍵與連接子偶聯。穩(wěn)定的二硫鍵連接子在血液循環(huán)中表現出良好的穩(wěn)定性，同時在細胞內保持有效的分裂。
此外，幾種基于maytansine的ADC利用相同的二級羥基作為附著點，并在大多數情況下攜帶轉谷氨酰胺酶生物結合的連接子。例如，一種基于Daratumumab的ADC被證明能向CD38過度表達的癌細胞特異性地傳遞DM4。最近ImmunoGen開發(fā)了一種新型的ADC，它包含一種含硫的maytansinoid，通過一種高度穩(wěn)定的三肽連接體連接到抗體上，附著點與上述羥基相同。與先前的美登素ADC相比，增加連接物中亞甲基單元的數量增加了旁觀者殺傷活性，并提高了小鼠體內的療效。在類似的方法中，保持核心大環(huán)不變，Regeneron和Abzena的研究人員研究了N-甲基丙氨酸氮取代的影響，也改變了大環(huán)上側鏈的長度，以及通過伯胺和仲胺連接的連接子。
微管溶素
Tubulysins是微管聚合的有效抑制劑，可導致分裂細胞的細胞骨架迅速解體，并導致細胞凋亡。它們是一個天然存在的四肽家族，含有Mep、Ile、Tuv和Tut，R3=OH或Tup，R3=H。
利用Tubulysins作為ADC有效載荷，其廣泛的附著點已被充分開發(fā)。這種結構中一個明顯的附著點是Tut或Tup模塊的羧酸，如Endocyte的EC1428，其中羧酸通過酰肼部分連接到連接子。Oncomatryx公司也采用了同樣的方法，以同樣的方式安裝了可切割的PABAValCit馬來酰亞胺連接子。
阿斯利康、百時美施貴寶和輝瑞使用的另一種方法依賴于Tup或Tut中苯環(huán)的衍生化。
連接子與Mep基團的連接也得到了廣泛的研究。Ingenica研究人員報告說，去甲基Mep類似物保留了強大的細胞毒性活性，可被視為有價值的有效載荷，允許在仲胺上引入不可切割的馬來酰亞胺己基連接子。
Oncomatryx的研究表明，當Mep被另一個擁有仲胺的基序取代時，通過氨基甲酸酯鍵引入可切割的連接體是產生ADC的有效途徑。特別有趣的是，基因泰克關于通過季銨基團將連接子連接到含叔胺的有效載荷上。在有效載荷上引入mc-Val-Cit-PABA連接子導致更多親水性結合物并改善了血液中的穩(wěn)定性。西雅圖遺傳學也采用了同樣的方法，通過過度表達葡萄糖醛酸，葡萄糖醛酸連接子也可以改善親水性和選擇性的細胞內切割通過癌細胞中過表達的β-葡萄糖醛酸酶。
隱粘菌素
隱粘菌素（Cryptomycins，CR）是一個具有抗腫瘤活性的六元大環(huán)二肽家族。已有的臨床試驗的結果表明，在達到治療效果所需的劑量下，其毒性水平是不可接受的。
幾個小組嘗試將CR用于ADC，但是由于在CR中缺少偶聯位點，目前，有兩種不同的方法通過引入其它基團，使得能夠連接ADC的連接子。一種是由基因泰克的研究人員將苯轉化為芐胺以產生有效的有效載荷，這種有效載荷適合通過氨基甲酸酯鍵連接。在第二種方法中，四川大學的研究人員利用了隱霉素-52的前藥形式（CR55），它可以在生理條件下重新環(huán)化為CR52。
抗有絲分裂EG5抑制劑
紡錘體驅動蛋白（KSP，也稱為Eg5或KIF11）是一種ATP依賴性運動蛋白，參與細胞周期中心體的分離。因此，用KSP抑制劑（KSPis）阻斷有絲分裂中的這一重要事件可產生抗腫瘤效力。
拜耳發(fā)現了一個新的吡咯亞類的KSPis，他們研究了該分子不同位置與保持對KSP強親和力的連接子的連接兼容性。
同樣，諾華的研究人員使用含咪唑的KSP抑制劑作為Eg5 ADC。利用伯醇或仲酰胺部分，他們安裝了帶有馬來酰亞胺端基的不可裂解連接子。當與靶向HER2和c-KIT的抗體偶聯時，得到的ADC顯示出優(yōu)于Kadcyla的體內療效。
2. DNA損傷藥物
吡咯苯并氮卓類和吲哚氯苯并氮卓類
吡咯并[2,1-c][1,4]苯二氮雜卓（PBD）是一類具有抗腫瘤活性的天然產物。它們的作用方式是在DNA的小凹槽中進行選擇性烷基化，其中鳥嘌呤的N2與PBD上的親電N10/C11亞胺形成共價鍵。
西雅圖遺傳學使用SGD1882的苯胺作為附著點，模仿可切割連接子中常用的PAB單元，釋放自由的PBD有效載荷。StemCentrx與Spirogen合作，利用PBD的N-10位置連接一個氨基甲酸酯的連接子。同樣的氨基甲酸酯鍵也被Immunogen用于結構相似的吲哚氯苯偶氮卓二聚體（IBD）有效載荷。他們還報道了同一類IBD的不同方法，其中一個取代的苯環(huán)被用作兩個IBD單體的C8/C8'位置之間的連接物。
以類似的方法，Spirogen和Genentech設計了一種碘苯連接的PBD，允許在過渡金屬催化反應中引入不同的連接子。通過使用Sonogashira偶聯、Buchwald–Hartwig偶聯或疊氮化物-炔烴點擊反應，分別獲得炔烴、哌嗪或三唑連接的連接子有效載荷共軛物。
杜卡霉素
杜卡霉素是一種強大的細胞毒性物質，通過其高活性的環(huán)丙烷環(huán)與DNA的小凹槽結合，并在N3位置烷基化腺嘌呤。非環(huán)化的，鹵甲基形式的杜卡霉素細胞毒性活性顯著降低。由于分子中苯酚基團可作為內消旋體激活劑，從而形成親電環(huán)丙烷，因此杜卡霉素ADC開發(fā)中的連接策略集中于酚官能團的連接子連接。
在Synthon開發(fā)的SYD985中，苯酚基團是通過雙氨基甲酸酯連接連接子與Mc-val-cit-PABC有效載荷的位置。組織蛋白酶B裂解后，游離苯酚促進分子內重排成親電環(huán)丙基形式。Medarex采用了一種不同的方法，通過分子非烷基化部分的芳香胺連接連接子，并用N-甲基哌嗪氨基甲酸酯部分掩蔽苯酚前藥。在體內，苯酚將被釋放，隨后活性環(huán)丙烷將在羧酸酯酶的作用下形成。
喜樹堿
喜樹堿（CPT）及其衍生物是拓撲異構酶I抑制劑的經典例子。它們穩(wěn)定了拓撲異構酶誘導的DNA單鏈斷裂，當三元DNA-TOP1-抑制劑復合物遇到復制叉時，DNA發(fā)生雙鏈斷裂。天然喜樹堿是一種五環(huán)結構，其極低的溶解性阻止了其作為癌癥治療藥物的廣泛應用。其水溶性前藥伊立替康獲得了轉移性結直腸癌的上市許可。SN-38是伊立新坦的活性代謝物，通過人體肝臟羧酸酯酶的作用在體內生成，其可通過打開內酯環(huán)而失活。
Immunomedics建立了兩種不同的策略，通過其羥基部分結合SN-38。在一個例子中，連接子通過反應性更強的C-10苯酚基團連接，從而產生穩(wěn)定的氨基甲酸酯鍵，而在另一個例子中，通過C-20羥基，同時穩(wěn)定內酯形式，而C-20羥基對體內效力至關重要。
另一種適合ADC的非常有效的藥物是依沙替康（DDX-8951f）。這種喜樹堿類似物在其環(huán)己烷環(huán)上具有胺取代基，橋接7和9位。依沙替康的氨基有助于其水溶性，而環(huán)己烷環(huán)賦予的剛性被認為有利于活性內酯形式與非活性水解羥基酸的平衡。氨基羥基乙�；蒁Xd（1），而4-氨基丁�；蒁Xd（2），這兩種化合物都保留了依沙替康的生物活性。
懸垂的羥基和氨基是明顯的附著點，可使用酶可切割的Gly-Gly-Phe-Gly四肽連接子連接有效載荷。與抗HER2抗體偶聯產生的ADC在臨床環(huán)境中顯示出對抗HER2表達癌癥的巨大潛力。
DXd的環(huán)己胺環(huán)雖然被認為穩(wěn)定了生物活性內酯形式，但它攜帶了一個手性中心，使合成工作和SAR研究復雜化。為了克服這一困難，Immunogen的研究人員研究了一組新的喜樹堿類似物，這些類似物能夠與單抗偶聯。并且在這里，這個環(huán)被打開，額外的手性中心被消除。從一種常見的中間產物開始，研究人員嘗試了三種類型的結構，并隨后使用不同的聚苯胺連接子連接有效載荷。當與抗人表皮生長因子受體（HuEGFR）的抗體偶聯時，產生的ADC對EGFR陽性的HSC-2腫瘤異種移植模型有效。
卡奇霉素
卡奇霉素是一類被廣泛研究的烯二炔類抗生素，其結構和作用機制特別有趣和復雜，使其成為ADC有效載荷領域的一類抗生素。在ADC中連接calicheamicin的策略以市場上的adc Mylotarg為例，還有Besponsa。
有效載荷的釋放分兩步進行：在酸性細胞內環(huán)境中對腙進行敏感的裂解，然后通過細胞內谷胱甘肽還原二硫鍵。釋放的硫醇發(fā)生分子內1，4-加成的烯酮觸發(fā)伯格曼環(huán)化反應，產生一個二自由基。這種活性中間體能夠從脫氧核糖骨架中提取氫原子，產生雙鏈DNA斷裂，進而導致細胞死亡。
最近，從不列顛哥倫比亞地衣中發(fā)現的鏈霉菌中分離出一種新的烯二炔類天然產物，稱為uncialamycin。這種結構通過全合成得到證實，從那時起，一些高效的合成類似物被制備成ADC的潛在有效載荷。
BMS的研究人員表明，由于在各種肽偶聯條件下反應活性較低，因此，Uncialamycin的仲胺不是一個合適的連接點。研究人員合成了一種類似物，其中一個氨基直接引入到芳香環(huán)上，但這種苯胺的反應性也太弱，不能作為連接子引入的基團。另一方面，使用氨基乙基延伸物安裝脂肪族胺，為連接子提供了合適的連接點。
從后一個有效載荷中，他們使用蛋白酶可切割的二肽和不可切割的連接子制備前體。CD70-ADC具有可切割連接體，對腎癌細胞株具有高度特異性的細胞毒活性，而相應的不可切割ADC在同一細胞株上不具有活性。
最近，為了繼續(xù)這項工作，BMS的研究人員在設計的、高效的、化學穩(wěn)定的uncialamycin類似物中使用苯酚基作為附著點。使用新開發(fā)的苯酚烷基化，在有效載荷的苯酚基團上添加了一個經典的可裂解連接子。將產生的有效載荷與抗體偶聯，其在體外和體內均顯示抗原特異性抗腫瘤活性。
3. 創(chuàng)新藥物
凋亡誘導劑（Bcl-xL抑制劑）
抗凋亡Bcl-2家族成員（包括Bcl-xL）的過度表達是癌細胞獲得凋亡抵抗的機制之一。能夠阻斷Bcl-xL上BH3結合域的藥物可以觸發(fā)癌細胞凋亡。2017年，AbbVie首次以ADC的形式展示了BcL-xL抑制劑的有效載荷，其靶向表達EGFR的特定細胞或組織。有趣的是，研究人員在有效載荷上使用了三個不同的連接點來連接可切割的連接子。氨基烷基延伸的核心修飾用于在需要時建立合適的連接位點。
泰蘭司他丁及其類似物
靶向剪接體是一種參與mRNA加工的大型核糖核蛋白復合物，為靶向癌癥治療提供了一種有希望的治療選擇。有幾種天然產物能夠通過與不同的剪接體亞單位結合來抑制RNA剪接。最具代表性的是thailanstatin A，它可以與剪接體的SF3b亞單位結合，從而阻止RNA剪接。
Thailanstatin A缺乏一個適合連接連接子的基團。為了解決這個問題，將羧酸與乙二胺偶聯以引入含有胺的間隔基，該間隔基通常用于連接子的安裝。
將這種天然產物用于ADC的另一個困難是存在多種反應性功能。例如，中心核中的二烯可以通過Diels–Alder反應與用于生物結合的馬來酰亞胺部分反應。這個問題是通過使用另一個共軛部分，鹵代乙酰胺來解決的。結合這兩種修飾并包含可切割連接子的ADC首次在專利文獻中報道，并且聲稱它們在幾個表達HER2的細胞系中具有適度的活性。
最近，輝瑞報告說，羧酸直接與抗體的有效表面賴氨酸（無連接子偶聯）結合導致迄今為止最有效的Thailanstatin ADC。這些賴氨酸偶聯物的活性與藥物負載有關，而其他有效載荷類通常沒有觀察到這種特性。ADCs在胃癌異種移植模型中顯示出良好的作用。
鵝膏毒素
在ADC技術領域，使用類似amatoxins的轉錄抑制劑是一種相對較新的方法。九種天然存在的amatoxin衍生物具有相同的骨架結構，一個由八個L-構型氨基酸組成的大環(huán)，通過亞砜部分連接在色氨酸和半胱氨酸殘基之間。amatoxins的三個側鏈是羥基化的，OH基團具有良好的水溶性并與目標分子結合。兩種肽，α-鵝膏糖蛋白和β-鵝膏毒素，占所有毒素的90%。
在amatoxins上共使用過三個附著點產生ADC。第一次嘗試是將β-鵝膏毒素的羧基偶聯到IgG上賴氨酸的氨基，這種連接具有良好的血漿穩(wěn)定性和高細胞毒性，但這種生物偶聯的產率很低。二氫異亮氨酸的羥基也被認為是一個連接點，引入谷胱甘肽作為連接子，然后通過賴氨酸結合，可獲得體外細胞毒性和體內抗腫瘤活性優(yōu)異的ADC，但不幸的是，由于血清羧酸酯酶裂解連接子，導致其循環(huán)穩(wěn)定性差。第三種方法，附著于色氨酸的6-羥基代表了目前的標準程序，苯酚與各種連接子的醚化導致了高度穩(wěn)定和有效的ADC。由于鵝膏毒素其它氨基酸要么不具化學活性，要么是與RNA聚合酶II結合的關鍵，因此不能將其它的鵝膏毒素氨基酸（即羥脯氨酸、甘氨酸、異亮氨酸和半胱氨酸）用于偶聯。
基于amanitin的代表性的ADC為HDP-101。有效載荷本身是一種合成的金剛烷醇衍生物，優(yōu)化了穩(wěn)定性。與天然天麻素相比，兩個差異是色氨酸中沒有6′-OH，硫醚鏈取代亞砜。通過天冬氨酸側鏈上酰胺的形成，引入組織蛋白酶B-裂解連接子。
最近，Park及其合作者為含苯酚的有效載荷設計了一種新的連接基序（OHPAS）。它是一種二芳基硫酸鹽，一個芳基部分來自有效載荷，另一個來自連接基序的潛在苯酚基團。將該技術應用于曲妥珠單抗ADC中的a-鵝膏毒素，在體外和體內表現出強大的細胞毒性。
煙酰胺磷酸核糖轉移酶
煙酰胺磷酸核糖基轉移酶（NAMPT）是一種負責將煙酰胺轉化為煙酰胺單核苷酸的酶，其抑制劑在各種臨床前和臨床研究中顯示出有效性，但其臨床應用受到靶向毒性和劑量限制性毒性的限制，如血小板減少和胃腸道不良反應。
諾華公司的研究人員在NAMPT抑制劑有效載荷中的苯環(huán)對位中引入哌嗪部分，確定了合適的連接子附著點。這種分子在c-Kit和HER2表達細胞系上表現出納摩爾水平的效力，并且耐受性良好，在體內表現出靶向依賴性。
卡馬霉素
從庫拉索菌中分離得到兩種新的蛋白酶抑制劑，卡馬霉素A和卡馬霉素B。兩者都具有亮氨酸衍生的α,β-環(huán)氧酮彈頭直接連接到甲硫氨酸亞砜或甲硫氨酸砜。他們被發(fā)現能抑制釀酒酵母20S蛋白酶β5亞單位活性（糜蛋白酶樣活性）。此外，它們對肺癌和結腸癌細胞株具有很強的細胞毒性。
然而，由于它們的高效價，它們的選擇性較差，經常表現出毒副作用。因此，劇毒的卡馬霉素衍生物適合作為ADC的彈頭，可以保持所需的效力，并獲得更好的耐受性。所設計的類似物均在P2位置并入砜甲硫氨酸衍生物（如卡馬霉素B），而不是卡馬霉素A中的亞砜甲硫氨酸，因為這消除了亞砜基立體異構體混合物產生的結構復雜性。
第一代類似物在P4末端含有胺基，不幸的是，這個附著點并不合適，因為有效載荷顯示細胞毒性活性降低。第二代卡馬霉素類似物在P2側鏈上含有一個胺基，當短乙基氨基鏈延伸磺�；鶗r，效果最好。在第三代類似物中，芳基連接砜和胺，因此降低了它的堿性。第二代和第三代有效載荷都顯示出強大的體外活性，并用可切割或不可切割的連接子連接。不幸的是，沒有一種ADC對受試癌細胞系表現出比曲妥珠單抗更高的細胞殺傷能力。
連接子
連接子不僅是抗體與小分子有效載荷之間形成共價連接的分子部分，而且是靶向藥物治療中具有設計性質的關鍵元件。連接子的加入不應誘導聚集，并且需要確�？山邮艿腜K特性，同時限制有效載荷在血漿中的過早釋放（穩(wěn)定性），并使活性分子在靶向作用位點有效釋放。連接子分為兩類：不可切割型和可切割型。
1. 不可切割連接子
基于不可切割的連接子的ADC必須被內化，抗體部分需要被溶酶體蛋白酶降解以釋放活性分子。在ADC開發(fā)過程中已經探索了許多不可切割的連接子，最具代表性的是N-琥珀酰亞胺基-4-（N-馬來酰亞胺甲基）環(huán)己烷-1-羧酸鹽（SMCC），Kadcyla就是使用的此類型連接子。
這種結構的分解代謝導致Lys-SMC-DM1成為主要的腫瘤代謝物。此外，與這種連接子相連的藥物通常不能發(fā)揮旁觀者效應，因為釋放的分解代謝產物通透性較差。目前的研究主要集中在可切割的連接子上。
使用可切割連接子對于具內化和不具內化ADC的設計同樣可行，因為釋放是由切割位點（溶酶體和/或腫瘤環(huán)境）的性質觸發(fā)的。連接子可以分為兩大類：酶依賴性和化學（即非酶）依賴性。
2. 化學依賴性連接子
含有二硫鍵的連接子受到硫醇的親核攻擊以釋放活性載荷。盡管血漿中人血清白蛋白（HSA）的還原形式就是最豐富的硫醇，但它對大分子的反應性很差。胞漿中還含有高水平的谷胱甘肽（GSH），這是一種含有巰基的三肽，很容易與S-親核蛋白發(fā)生反應。血液（微摩爾范圍）和細胞質（毫摩爾范圍）中GSH濃度的差異以及癌細胞引起的氧化應激有助于藥物在癌細胞內的優(yōu)先釋放。含有二硫鍵的連接子主要與maytansinoid類有效載荷相關。二硫鍵的反應性可由空間位阻調節(jié)：α-甲基替換顯著影響還原速率和對硫醇-二硫鍵交換的抗性，如SAR-3419的連接子通過偕二甲基替換獲得SPDB-DM4最佳的抗腫瘤活性。
腙連接子顯示出依賴于pH的穩(wěn)定性，在中性pH下穩(wěn)定，并在酸性介質中水解（內體的pH<6，溶酶體的pH<5），形成相應的酮和肼。
該方法已成功應用于IMMU-110，包含一個可裂解�；赀B接子，由4-馬來酰亞胺甲基環(huán)己烷-1-羧酸鹽（MCC）的酰肼與阿霉素中存在的酮基反應中形成。
腙連接體也經常用于卡利霉素家族的有效載荷，在這種情況下，釋放是由兩步活化過程觸發(fā)的：第一步酸敏感腙被水解，第二步二硫鍵被GSH還原，使巰基中間體環(huán)化。這種連接子已經在上市的Mylotarg和Besponsa中使用，但是它們在血漿中的穩(wěn)定性不如預期，也不如其他可切割連接子吸引人。
3. 酶依賴性連接子
為了限制有效載荷在內化前的釋放，從而防止或最小化目標細胞外的降解，溶酶體的蛋白質組分成為尋找能夠降解ADC并以高濃度存在的酶的合理場所。
組織蛋白酶-B
組織蛋白酶B是一種半胱氨酸蛋白酶，存在于哺乳動物的晚期內體和溶酶體中，在許多癌細胞中也過度表達。最初，一種可切割的二肽作為組織蛋白酶B的底物用作阿霉素前藥，這項工作建立了SAR的二肽部分：P1位置需要親水性殘基（瓜氨酸或精氨酸），而P2位置的親脂性殘基增強血漿穩(wěn)定性（苯丙氨酸、纈氨酸或丙氨酸）。
此外，還引入了一個自降解間隔子來促進酶的進入，從而限制了有效載荷的空間位阻：對氨基芐基氨基甲酸酯（PABA）在酸性介質中自發(fā)1,6-消除，釋放二氧化碳、對氮雜醌甲酰胺和阿霉素。最終，這一發(fā)現從前藥轉移到ADC領域，證明了Val-Cit和Phe-Lys二肽連接子的抗原驅動的細胞活性。
Val-Cit二肽是ADCs中最常用的可裂解連接子，目前有多達25個分子處于臨床階段，可能是因為其整體良好的血漿穩(wěn)定性、釋放行為和化學可牽引性。兩個已獲批的ADC藥物（Adcetris和Polivy) 都使用了相同的連接子mc-VC-PABC，其中包含馬來酰亞胺基間隔子、作為組織蛋白酶底物的標準Val Cit二肽序列和PABC自降解間隔子。
Val-Ala二肽也被廣泛應用，有7個分子處于臨床階段，進展最快的是Loncastuximab tesirine，其包括一個聚乙二醇化間隔子，以平衡屬于PBD二聚體家族的有效載荷SG3199的親脂性。
研究表明，由于沉淀和聚集，Val-Cit很難實現高DAR。相反，Val-Ala連接子允許DAR高達7.4，且聚集有限（<10%）。與Val-Cit相比，Val-Ala的疏水性較低，這解釋了為什么這種連接子在親脂性的有效載荷（如PBD二聚體）方面表現卓越，7個臨床候選ADC的Val-Ala連接子都連接PBD。
一些研究將Val-Cit和Val-Ala二肽結構與MMAE的有效載荷連接進行了比較。在非內化抗體的情況下，結合到工程化半胱氨酸的Val-Cit和Val-Ala連接子都表現出類似的特征，并且比Val-Lys和Val-Arg類似物表現出更好的性能。在使用隨機半胱氨酸結合的抗Her2 ADC的情況下，與Val-Cit相比，Val-Ala在高DAR結構中顯示出較少的聚集性。另一方面，兩種連接子顯示出相似的緩沖穩(wěn)定性、組織蛋白酶B釋放效率、細胞活性和組織病理學特征。
四肽Gly-Gly-Phe-Gly顯示出穩(wěn)定和有效的可切割連接子的所有特性，已上市的ADC藥物Enhertu使用了此類連接子。第一三共的Enhertu是一種血漿穩(wěn)定的ADC，DAR為7.7，在溶酶體中發(fā)生蛋白酶降解，釋放DX-8951f，這是一種有效的拓撲異構酶I抑制劑，來源于exatecan。由于連接子不含增溶劑，達到如此高的DAR是非�？捎^的，因為它與廣泛確立的原理相矛盾，即高DAR結合物可能具有較差的藥代動力學特征。這里使用的自降解間隔子是簡單和緊湊的半胺化，而不是Val-Cit連接子使用的PABC。
磷酸酶和焦磷酸酶
與組織蛋白酶一樣，焦磷酸酶和磷酸酶也是在溶酶體中選擇性表達的水解酶。2016年，默克公司的研究人員設計了含有磷酸和焦磷酸的連接子與組織蛋白酶B敏感的Val-Cit-PABA搭配，旨在傳遞糖皮質激素：磷酸鹽/焦磷酸鹽部分結合在自降解間隔子PABA和有效載荷之間。內化后，有效載荷可通過組織蛋白酶B、自降解間隔子和磷酸酶（n=1）的順序釋放。對于焦磷酸酯（n=2），可能需要另一個涉及焦磷酸酶的步驟。
這種親水性和永久性帶電基團的優(yōu)點是溶解性，不僅能夠與親脂性糖皮質激素衍生物進行生物偶聯，而且促進ADC純化， ADC中的殘余連接子少于0.10%。含有磷酸和焦磷酸的ADC在體外都具有活性。
默克公司的同一組研究人員還開發(fā)了一種獨特的基于焦磷酸酶的連接子，用于釋放含羥基有效載荷地塞米松和丙酸氟替卡松。
此外，羥基附著點的性質對有效釋放至關重要。地塞米松的伯醇效果良好，而更受阻的氟替卡松的仲醇需要一個縮醛間隔子，從而實現可接受的釋放。兩種ADC在體外均表現出良好的穩(wěn)定性，對腫瘤細胞系具有較強的活性。
β-葡萄糖醛酸酶
β-葡萄糖醛酸酶是一類糖苷酶，催化β-葡萄糖醛酸殘基的水解，它在溶酶體和腫瘤間質中高表達。西雅圖遺傳學的研究人員于2006年發(fā)表了一項開創(chuàng)性的工作，抗CD70 ADC使用了含葡萄糖醛酸的連接子，葡萄糖醛酸附著在自降解間隔子上。這種連接子表現出低水平的聚集、高血漿穩(wěn)定性、以及強大的體內功效。
該連接子還通過一個額外的二甲基乙二胺（DMED）自降解間隔子應用于其他含胺的有效載荷，如喜樹堿類似物、SN38、杜卡霉素和苦參堿。釋放順序從水解β-葡萄糖醛酸到自降解間隔子，DMED的另一個環(huán)化反應自發(fā)發(fā)生，形成1,3-二甲基咪唑啉-2-酮，并最終釋放含羥基藥物。由于連接子的親水性，與組織蛋白酶敏感連接子相比，該技術使ADC的DAR=8制備更為容易。
β-半乳糖苷酶
最近報道了一種使用β-半乳糖苷酶裂解連接子的ADC，其中包含PEG10間隔子。間隔子被硝基取代，以提高自降解速率。類比β-葡萄糖醛酸酶連接子，其解離機制涉及水解β-半乳糖苷酶部分，它賦予化學前體親水性。另一個優(yōu)勢是β-半乳糖苷酶僅存在于溶酶體中，而β-葡萄糖醛酸酶在溶酶體中表達，也在實體瘤的微環(huán)境中表達。研究證明，在抗HER2-ADCs釋放MMAE的背景下，含β-半乳糖苷酶連接子的 ADC在體外和體內均比T-DM1更為有效。
硫酸酯酶
最近，出現了硫酸酯酶裂解的連接子，硫酸酯酶在幾種癌癥類型中過度表達，表現出潛在的選擇性。研究涉及以MMAE為有效載荷的抗Her2抗體，與經典的可切割Val-Cit和Val-Ala連接子相比，硫酸酯酶連接子對Her2+細胞系顯示出相似的效力。
生物偶聯技術
1. 基于化學的特異性原位抗體修飾
單克隆抗體的天然結構為生物偶聯提供了多種可能性，基于化學的、特異性的天然（非工程）抗體偶聯具有一些優(yōu)點。它可以避免抗體特定位點突變的復雜性，以及在細胞培養(yǎng)的放大和優(yōu)化方面可能面臨的挑戰(zhàn)。
偶聯位點根據抗體序列，賴氨酸、組氨酸、酪氨酸和半胱氨酸等內源性氨基酸在二硫鍵間的連接位點非常具有吸引力。所有經FDA批準的ADC，直到2021年，都利用這些內源性氨基酸進行偶聯。然而，抗體支架還包含聚糖，這是在單克隆抗體生產過程中，FC區(qū)域的翻譯后修飾所導致的。一些研究報告了糖工程化的新策略，這似乎是一種有趣的生物偶聯替代方法。
與內源性氨基酸的偶聯
最常見的偶聯方法之一是利用抗體的賴氨酸殘基，氨基酸親核NH2基團與利克有效載荷上親電的N-羥基琥珀酰亞胺（NHS）基團發(fā)生反應。盡管反應簡單，但可利用賴氨酸殘基的高豐度導致了許多ADC在隨機分布下的不均勻混合物的形成。DAR受藥物/抗體化學計量比的控制，該方法得到廣泛應用，包括已獲批的ADC，如Besponsa, Mylotarg, 和Kadcyla。
最近，同樣也報道了對賴氨酸位點和殘基的特異性修飾。通過計算機輔助設計，磺酰丙烯酸酯被用作中間試劑，用于在天然蛋白質序列上對單個賴氨酸殘基進行修飾。
反應的區(qū)域選擇性歸咎于磺酰丙烯酸酯的設計以及每個賴氨酸周圍獨特的局部微環(huán)境。通過計算預測，pKa最低的賴氨酸容易以位點特異性的方式在弱堿性pH下優(yōu)先反應。即使在其他親核殘基如半胱氨酸存在的情況下也觀察到了這種反應。該技術已應用于5種不同的蛋白質和曲妥珠單抗，在偶聯后均保留了原有的二級結構和蛋白質功能。
2018年，Rai等人報告了另一種利用“化學關鍵蛋白”的可逆分子間反應進行的位點特異性修飾。該試劑攜帶多種官能團，這些官能團在所有可獲得的賴氨酸殘基上可逆地形成亞胺部分。然后，關鍵蛋白通過試劑中的環(huán)氧化物與近端組氨酸殘基反應。因此，在生理條件下，關鍵蛋白從賴氨酸中分離，醛被再生，從而能夠通過肟結合標記抗體。
這種關鍵蛋白的定向修飾技術后來發(fā)展成單賴氨酸殘基標記技術，即使在存在N-末端胺的情況下也具有毋庸置疑的選擇性。方法的成功依賴于Fk1-間隔子-Fk2試劑。
Fk1官能團與賴氨酸可逆反應，調節(jié)Fk2近端賴氨酸部分的微環(huán)境。然后通過酰胺鍵在Fk2處的賴氨酸殘基（K169和K395）進行偶聯，間隔子的設計調節(jié)偶聯的位置。該方法已成功應用于ADC（trastuzumab-emtansine）的合成，證明其細胞活性與已獲批準的Kadcyla相當。
Merlul等人最近報道了一種不同的結合策略，有效地靶向天然抗體上的組氨酸殘基。他們引入了一種基于陽離子有機金屬鉑（II）的連接子，[乙二胺鉑（II）]2+，圖中表示為Lx。
這種技術基于絡合和偶聯兩個步驟。氮雜環(huán)配體如哌啶與Lx配位形成絡合物前體，穩(wěn)定的中間體包含有效載荷和配體上的一個氯離子。該復合物含有帶正電荷的Pt（II）中心，這提高了連接子和有效載荷復合物的水溶性并最小化抗體聚集，該方法還擴展到類似的碘絡合物。在最近的一份報告中，碘化鈉的使用被證明可以顯著提高該技術的偶聯產率和選擇性。Cl-Lx-藥物載荷絡合物上殘留的氯配基與碘化物的交換生成更具活性的I-Lx-藥物載荷，從而獲得更高的偶聯產率。這項技術已被應用于ADC藥物的大規(guī)模生產。
二硫化物重橋接策略
IgG抗體包含四個鏈間二硫鍵，兩個連接輕鏈和重鏈，兩個位于連接兩條重鏈的鉸鏈區(qū)，它們維持著單克隆抗體的完整性。另一個經典的生物偶聯途徑探索了這些半胱氨酸作為有效載荷連接點的作用。四個二硫鍵的還原通常會產生八個巰基，它們能夠與馬來酰亞胺的連接子反應，從而產生DAR為8的ADC。
Doronina及其同事報告了嵌合抗CD30單克隆抗體偶聯MMAE，DAR=8的 ADC實例。與經典的賴氨酸偶聯相比，這種有效載荷加載方式得到了更好的控制。然而，據報道，較高的藥物負荷會增加聚集的風險，從而導致高血漿清除率，并降低體內療效。
Badescu和al在2014年報告了一種新的位點特異性重橋接偶聯策略，他們是第一個證明新的雙砜（bis-sulfone）能夠烷基化來自抗體和抗體片段中還原二硫鍵的兩個巰基，對抗原結合的影響最小。后來，Wang和al描述了一種新的水溶性烯丙砜（allyl sulfone），該試劑在沒有原位活化的情況下提高了反應活性。它表現出高穩(wěn)定性、高水溶性和位點特異性。
此外，還有巰基炔與末端炔烴和環(huán)辛炔生物偶聯的再橋接技術，其進一步發(fā)展出新一代馬來酰亞胺，如二溴-（DBM）和二硫代馬來酰亞胺（DTM），用于位點特異性偶聯。這些馬來酰亞胺類似物在第3位和第4位含有良好的脫離基團，從而實現快速、高效和高產率的偶聯。最近報道了結合二溴和二硫代馬來酰亞胺性質的雜化硫代溴馬來酰亞胺（TBM），這種TBM試劑結合更快，顯示出更高的DAR=4的百分比，這可能是由于溴減少了空間位阻。
2015年，Chudasama等人引入了一類新的重橋接試劑，二溴吡啶二酮（dibromopyridazinediones）。他們證明了它能有效地插入到二硫鍵中，得到的結構即使在高溫下也表現出了極好的水解穩(wěn)定性。然而，隨著還原步驟上的溫度升高，也觀察到不均一性，這種結構也允許選擇性地引入不同的功能基團。
二乙烯基嘧啶（Divinylpyrimidine）是另一種有效的重橋接試劑，能夠產生穩(wěn)定的DAR=4的ADC。Spring等人研究了乙烯基雜芳基支架對半胱氨酸再橋接的作用，他們認為用嘧啶取代吡啶可以使雜芳環(huán)成為更好的電子受體，從而提高交聯效率。他們的工作擴展到二乙烯基三嗪，在高溫下，重橋接顯示出更高的效率。
為了避免與經典馬來酰亞胺偶聯相關的體內不穩(wěn)定性的缺點，Barbas等人研究了甲基磺�；交鶒憾�，該試劑對半胱氨酸具有特異性反應。與血漿中的半胱氨酸-馬來酰亞胺偶聯物相比，他們的穩(wěn)定性更高。受此啟發(fā)，Zeglis設計了DiPODS試劑，該試劑含有兩個通過苯基連接的惡二唑基甲基砜部分， DiPODS以重橋接的方式與兩個硫酸根形成共價鍵。與馬來酰亞胺偶聯相比，以這種方式偶聯具有優(yōu)越的體外穩(wěn)定性和體內性能。
聚糖偶聯
由于IgG是一種糖蛋白，它在Fc片段每個重鏈的CH2結構域N297位置包含一個N-聚糖，這種糖基化可以作為連接有效載荷的附著點。多糖與Fab區(qū)域間遠距離定位降低了在偶聯后損害抗體的抗原結合能力的風險，此外，與抗體的肽鏈相比，它們的化學組成不同，允許位點特異性修飾，使它們成為合適的偶聯位點。
聚糖生物偶聯可根據用于靶向碳水化合物的技術來區(qū)分：包括聚糖代謝工程化、聚糖氧化后的糖轉移酶處理、內糖苷酶和轉移酶處理后的酮或疊氮化物標記。
Neri等人報道了在IgG抗體的N-糖基化位點處巖藻糖的位點特異性修飾。這種糖含有一個順式二醇部分，適合選擇性氧化。他們用偏高碘酸鈉氧化巖藻糖殘基，生成一個能夠與含聯氨的連接子反應的醛基，這樣，抗體通過腙鍵與藥物相連。
Senter及其同事向細胞培養(yǎng)基中添加硫基類似物，通過代謝將6-硫代巖藻糖帶入抗體修飾。他們認為，取代是通過劫持巖藻糖基化途徑來完成的，這樣就引入了化學位點來實現位點特異性結合。與經典半胱氨酸偶聯物相比，這種方法顯著降低了異質性水平，并產生具有更可預測的藥動學和藥效學特性的偶聯物。
重組IgG中很少含有唾液酸，然而，已經證明，利用半乳糖基和唾液酸轉移酶可以酶法改造甘氨酸。通過酶反應添加半乳糖以獲得G2聚糖，然后添加末端唾液酸。這種修飾通過高碘酸氧化生成醛基，可以偶聯帶羥胺基團的連接子-有效載荷。所得的偶聯物具有較高的靶向選擇性，體內抗腫瘤活性良好。高碘酸還可氧化蛋氨酸等敏感氨基酸，影響與FcRn的結合。
除這些偶聯策略外，半乳糖殘基也可以作為修飾位點。多項研究報告了通過使用突變的β- 1，4-半乳糖轉移酶，將半乳糖替換為一種含酮或疊氮官能團的半乳糖，這種具有雙正交官能團的半乳糖衍生物為高效偶聯開辟了途徑。這些技術已被開發(fā)用于成像和抗癌應用。
從化膿性鏈球菌中發(fā)現的內糖苷酶EndoS和EndoS2，這些酶能夠水解IgG的N-聚糖，從而使水解后的殘基成為生物偶聯的有效位點。這種方法有助于使單抗的聚糖結構均勻化，同時它也適用于任何IgG亞型。此類方法應用于trastuzumab-maytansine，制備出具有良好體外和體內藥效的糖偶聯ADC。
2. 工程化抗體的位點特異性生物偶聯
生物正交化學和蛋白質工程領域的進展有助于產生更均勻的ADC。盡管在天然單抗上有許多可用的附著方法可供選擇，但在工程化抗體上的位點特異性生物偶聯能夠更有效地控制DAR，并且避免改變與抗原結合的親和力。這樣，在某些位置加入天然或非天然氨基酸，得到具有優(yōu)良藥代動力學和藥效學特征的同質產品。
酶法
有效載荷的附著可以通過在抗體序列中插入特定的氨基酸標簽以非常有選擇性的方式實現。這些標簽被特定的酶所識別，例如甲酰甘氨酸生成酶（FGE）、微生物谷氨酰胺轉胺酶（MTG）、轉肽酶或酪氨酸酶，從而能夠執(zhí)行位點特異性偶聯。
Aaron等人探索了一種新的利用醛標記蛋白質的位點特異性偶聯。該技術利用了基因編碼的五肽序列（Cys-X-Pro-X-Arg），其中半胱氨酸殘基被FGE識別，并在細胞中蛋白質表達期間被共翻譯氧化為甲酰甘氨酸。這樣，工程化抗體通過HIPS（hydrazino-Pictet–Spengler）化學方法與醛特異性連接子選擇性偶聯。
微生物轉谷氨酰胺酶（MTGase）策略也經常被開發(fā)用于定位特異性偶聯。MTGase催化在脫糖抗體295位置的谷氨酰胺側鏈與底物的伯胺之間形成肽鍵。與其他酶策略相比，MTG是一種靈活的技術，不需要肽供體來實現偶聯。只要�；荏w含有一種伯胺，就沒有結構限制。
谷氨酰胺殘基自然存在于單抗的每個重鏈的Fc區(qū)域。在295位去糖基化后，谷氨酰胺殘基通過MTGase介導的反應偶聯，可以產生均一的DAR=2的ADC。為了提高效率，可以偶聯帶支鏈的連接子，從而使DAR翻倍，297位的天冬酰胺突變?yōu)楣劝滨０芬部稍黾覦AR。
NBE Therapeutics開發(fā)了基于S金黃色葡萄球菌轉肽酶A介導的偶聯。他們的策略利用轉肽酶A（SrtA），在LPXTG（X=任何氨基酸）五肽的基序中切割蘇氨酸和甘氨酸殘基之間的酰胺鍵。然后，它催化甘氨酸相關的有效載荷與新生成的C-末端的偶聯，在生理溫度和pH下生成肽鍵。
該方法應用于不同抗體，如抗CD30和抗Her2，并使用含有5甘氨酸標記的連接子偶聯maytansine和MMAE，兩種ADC均顯示出與經典偶聯相似的體外細胞殺傷活性。酶法產生的trastuzumab-maytansine在體內試驗中完全匹配Kadcyla。
在另一個例子中，利用轉肽酶法生成了高效蒽環(huán)素毒素衍生物PNU-159682的ADC。有趣的是，通過這項技術，偶聯效率甚至高于Adcetris和Kadcyla類似物。此外，所制備的PNU-159682 ADC具有較高的體外和體內穩(wěn)定性，并且顯示出的效力超過了含有微管蛋白靶向有效載荷的ADC。
另一個新興的新方法是通過酪氨酸標簽進行位點特異性抗體標記，酪氨酸標簽與單克隆抗體輕鏈的C末端基因融合�？紤]到位點可及性，Bruins及其同事使用了一種工程化的四甘氨酰酪氨酸殘基作為標記，它為偶聯提供了一個容易觸及的位點。酪氨酸酶將酪氨酸氧化成1,2-醌，從而允許與各種雙環(huán)[6.1.0]壬炔（BCN）衍生物的環(huán)加成反應。這種方法可以與含有BCN連接子的MMAE有效地偶聯。
半胱氨酸工程：硫單抗技術
隨機半胱氨酸偶聯和重橋接是利用抗體結構內天然存在的半胱氨酸殘基的技術。然而，隨機半胱氨酸方法的異質性以及重橋接策略中的單抗片段化需要在ADC合成中加以考慮，特別是當疏水性藥物被偶聯時。
與它們不同的是，硫單抗技術通過利用不涉及結構二硫鍵的工程化反應性半胱氨酸，在抗體上實現所需位點的選擇性和均勻修飾。一般來說，半胱氨酸突變的設計是為了促進細胞毒性有效載荷偶聯的同時，保持單克隆抗體的穩(wěn)定性、親和力和最小化ADC聚集。為了確定突變的最佳位置，通常采用幾種技術，包括計算建模、模型系統(tǒng)篩選和高通量掃描。
Junutula等人首先報道了一種硫單抗策略，用工程化半胱氨酸殘基取代了抗MUC16抗體重鏈114位的丙氨酸（HC-A114），工程化位置內的反應性硫醇能夠與馬來酰亞胺負載的連接子反應。合成的抗MUC16 ADC在異種移植小鼠模型中表現出效力，在大鼠和食蟹猴中表現出高劑量耐受性，這個發(fā)現建立了硫單抗偶聯策略的一般性方法。
此外，琥珀酰亞胺連接在胞漿內可以經歷兩個平行反應：反向Michael反應導致連接子-有效載荷的損失，以及琥珀酰亞胺的水解，這兩種反應都對體內ADC活性有顯著影響。為了提高穩(wěn)定性，Lyon和合作者設計了一個與馬來酰亞胺相鄰的堿性氨基整合進來的連接子。在連接子中加入二氨基丙酸（DPR）促進了硫琥珀酰亞胺在中性pH和室溫下的快速定量水解，這樣，非特異性的去偶聯作用被阻止，從而提高了體內的穩(wěn)定性。除了常用的馬來酰亞胺外，還探索了不同的半胱氨酸反應劑，如碘乙酰胺、溴甲酰胺、羰基丙烯酸酯，N-烷基乙烯基吡啶鹽。
3. 與工程化非天然氨基酸的生物偶聯
除了硫單抗技術外，非標準氨基酸（ncAA）的加入為位點特異性偶聯提供了另一種可能性。該技術使用含有獨特化學結構的氨基酸，從而能夠以化學選擇性的方式引入連接子-有效載荷復合物。該技術需要對抗體序列重組，利用與宿主細胞內所有內源性tRNAs和合成酶正交的tRNA和氨基酰tRNA合成酶（aaRS），用于響應未賦值密碼子將ncAA帶入蛋白質。通常，ncAA在發(fā)酵過程中被添加到培養(yǎng)基中。選擇非天然氨基酸是很重要的，因為它們可能激發(fā)免疫原性。常用的ncAA是具有獨特基團的天然氨基酸的類似物，如酮、疊氮、環(huán)丙烯或二烯。
已有研究將對乙酰苯丙氨酸（pAcF）成功地整合入抗CXCR4 抗體中。有效載荷Auristin通過肟連接與抗體有效偶聯，從而生成化學均一的ADC。該ADC在小鼠體內表現出良好的體外活性和完全清除肺腫瘤的作用。
由于肟連接所需的酸性條件和ADC緩慢釋放的動力學，另一種選擇是加入含ncAA的疊氮化物。廣泛應用的對疊氮哌苯胺（pAzF）可在生理條件下快速進行CuAAC或SPAAC反應，利用這種策略成功地在抗CD74抗體上偶聯糖皮質激素有效載荷。除了pAcF技術外，還成功地將含疊氮的賴氨酸類似物（AzK）帶入到抗體中，以產生具有Auristin、PBD二聚體或微管蛋白有效載荷的位點特異性ADC。
此外，賴氨酸的環(huán)丙烯衍生物（CypK）以及自然發(fā)生的非典型氨基酸，如硒代半胱氨酸（Sec）都成功地整合進入抗體中。所產生的ADC表現出良好的穩(wěn)定性、選擇性以及體外和體內活性。
ADC的進化史
Mylotarg、Besponsa和第一代可切割連接子
Mylotarg于2000年被FDA批準用于治療急性髓細胞白血�。ˋML）。它是由卡奇霉素通過一個包含腙鍵的可切割連接子與gemtuzumab（一種突變的抗CD33 IgG4亞型單抗）偶聯而成。這種ADC的平均藥物抗體比(DAR)只有1.5，含有約50%的未偶聯單克隆抗體。ADC內化后，腙鍵可在內體酸性環(huán)境中水解，釋放出卡奇霉素的前體，然后由谷胱甘肽還原為自由活性的卡奇霉素。后者與DNA小凹槽結合并經歷Bergman環(huán)化，從而產生高度反應性的雙自由基，引起序列選擇性DNA雙鏈切割。
從理論上講，腙在生理pH值下應在血液循環(huán)中保持穩(wěn)定，并在酸性條件下內化后進行選擇性水解。然而，Mylotarg的連接子表現出一定的不穩(wěn)定性，導致卡奇霉素在血漿循環(huán)中過早釋放，嚴重的毒性導致隨后輝瑞公司在2010年將Mylotarg退市。
得益于近年來在臨床上積累的經驗以及技術的進步，Mylotarg于2017年重新獲批，優(yōu)化后提高了連接子的穩(wěn)定性，以較低劑量使用，并修改給藥計劃，適用于不同的患者群體。
一個類似的連接子被開發(fā)出來并用于將卡奇霉素偶聯到inotuzumab，一種突變的CD22靶向抗體上， inotuzumab-ozogamicin (Besponsa）于2017年被FDA批準用于治療急性淋巴細胞白血�。ˋLL）。
Kadcyla和第二代不可切割連接子
鑒于這些發(fā)現，人們繼續(xù)開發(fā)連接子設計的替代策略。然而，一個偶然的發(fā)現使Immunogen得以識別出一種出人意料的有效ADC。DM1通過含有N-琥珀酰亞胺基-4-（N-馬來酰亞胺甲基）環(huán)己烷-1-羧酸鹽（SMCC）的不可切割的連接子與曲妥珠單抗的賴氨酸殘基偶聯，這種ADC（T-DM1，Kadcyla）于2013年經FDA批準用于HER2陽性乳腺癌患者。
這種新型的ADC在HER2陽性乳腺癌模型中非常有效，只有ADC在內化后在溶酶體中經酶完全消化后，原始結構才具有活性，以獲得活性代謝物Lys-MCC-DM1。
Adcetris, Polivy和第二代可切割連接子
與此同時，西雅圖遺傳學設計了自己的偶聯技術，通過可切割連接子mc-VC-PABC，其中包含馬來酰亞胺基間隔子、作為組織蛋白酶底物的標準Val Cit二肽序列和PABC自降解間隔子，將金盞花素（MMAE）生物偶聯到抗CD30 抗體的半胱氨酸殘基上，這種ADC（Adcetris）于 2011年被FDA批準用于間變性大細胞淋巴瘤和霍奇金淋巴瘤的治療。
Adcetris在腫瘤細胞內化后，可切割連接子降解，釋放出的MMAE能破壞靶細胞并擴散到細胞膜上，到達并殺死鄰近的癌細胞。這種現象被稱為旁觀者效應，允許釋放的MMAE殺死CD30陽性和CD30陰性的腫瘤細胞。
類似地，這種第二代連接子（mc-VC-PABC）被用于Polivy，一種將MMAE與polatuzumab（抗CD79b單抗）偶聯的ADC，于2019年6月被FDA批準用于治療成人彌漫性大B細胞淋巴瘤（DLBCL）。
第三代位點特異性的ADC
盡管ADC取得了越來越大的成功，但直到2019年，市場上每一個批準的ADC都是以異質混合物的形式存在的，單抗上的細胞毒性藥物數量不同且分布在不同的地方，導致了生產過程中的分析問題。事實上，DAR是不受控制的，這種復雜的混合物會顯著影響ADC的藥代動力學和藥效。
裸抗體可能是一種競爭性抑制劑，弱DAR偶聯物的療效較差，而具有高DAR的抗體在血漿中會被迅速消除，從而損害了ADC的治療窗口。為了拓寬ADCs的治療指數，自2008年以來，區(qū)域特異性生物結合方法得到廣泛發(fā)展。這些位點特異性方法可分為三類：（i）天然或非天然氨基酸的生物偶聯，（ii）使用酶的生物偶聯或（iii）基于連接物的生物偶聯。
第一種方法是通過抗體工程引入特定的氨基酸。Junutula和他在Genentech的同事是先驅者，他們通過在靶向卵巢癌抗原MUC16的單克隆抗體的265位氨基酸與Adcetris®連接子進行定點生物偶聯，開發(fā)出一種ADC。為此，他們在單克隆抗體的氨基酸序列中引入了兩種半胱氨酸，選擇了這兩種半胱氨酸來保持IgG折疊和與抗原結合。
將得到的TDC（ADC-硫單抗）與使用傳統(tǒng)隨機生物結合方法生成的ADC進行比較。
兩種ADC在小鼠異種移植模型中均有效，但TDC在大鼠和食蟹猴體內的耐受性高于ADC，并且在體內表現出較低的全身毒性。受此策略的啟發(fā)，Seattle Genetics和Spirogen開發(fā)了一種類似的技術，稱為MAIA，通過在mAb關鍵區(qū)域的239位引入絲氨酸半胱氨酸突變，實現PBD二聚體的生物偶聯。
第二種可能性是使用酶介導的區(qū)域特異性生物結合技術。谷氨酰胺轉胺酶催化天然單抗的谷氨酰胺側鏈與含有伯胺的分子之間形成酰胺鍵�；诖�，Innate Pharma已經開發(fā)了一種使用谷氨酰胺轉胺酶構建ADC的三步方法，如下圖所示。
最后，區(qū)域特異性ADC也可以從天然單抗中產生。
在這一策略中，由創(chuàng)新的二溴甲基酰胺（DBM）或二噻吩基馬來酰亞胺（DSPh）組成的異質雙功能連接體可以通過區(qū)域特異性生物偶聯產生更均勻和更穩(wěn)定的ADC，DAR為4。
小結
在過去的十年中，ADCs已經通過選擇更好的細胞毒性藥物、生物偶聯方法、更好的靶向抗原和優(yōu)化的抗體工程得到了改進。然而，它仍存在一些局限性（如有限的實體瘤滲透性和毒性）以及耐藥機制的出現。
為了克服這些局限性，人們研究了新的抗體形式、新的傳遞系統(tǒng)、非內化抗原靶點、新的細胞毒性藥物和位點特異性生物偶聯方法來促進ADC的發(fā)展。雖然許多創(chuàng)新尚未在臨床方案中得到驗證，但這一領域的研究為我們提供了許多令人鼓舞的結果。相信ADC未來的十年將會迎來更加輝煌的前景。
參考文獻：
1.The Chemistry Behind ADCs. Pharmaceuticals (Basel). 2021 May; 14(5): 442.
2. Antibody–Drug Conjugates: The Last Decade. Pharmaceuticals 2020, 13, 245
原文標題 : 帶你全面了解ADC
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