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應用氧化還原平衡工程提高釀酒酵母L-乳酸產(chǎn)量

2019-09-14 04:01

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文章背景簡介

BACKGROUND INTRODUCTION

聚乳酸是一種可再生的原材料，越來越多地用于生物塑料的制造，它提供了一種可持續(xù)的替代石油的材料。最近關(guān)注的焦點集中在合成聚乳酸的L－乳酸單體的生產(chǎn)上。L－乳酸通常由乳酸菌在碳水化合物發(fā)酵中大量產(chǎn)生，由于這些微生物對pH較敏感，工業(yè)乳酸生產(chǎn)需要添加大量的中和劑，如CaCO3、NaOH和NH4OH，這些中和劑損害了乳酸鹽沉淀的再生，并且增加了成本，因此限制了乳酸的生產(chǎn)。

丙酮酸脫羧酶（PDC1，PDC5和PDC6）編碼基因的缺失以及異源NAD＋依賴性乳酸脫氫酶的表達，會導致釀酒酵母菌株能夠在很少或沒有乙醇形成的情況下產(chǎn)生乳酸。雖然這確實使乙醇減少甚至消失，但乳酸產(chǎn)量并沒有很大的提高。

代謝過程中，氧化還原輔因子在耦合分解代謝和合成代謝以及能量產(chǎn)生中起著關(guān)鍵作用。細胞中的氧化還原輔因子是動態(tài)消耗的，且由許多同時發(fā)生的氧化還原反應補充。因此，氧化還原輔助因子的擾動影響產(chǎn)品概況和細胞內(nèi)代謝物水平。事實上，通過靶向氧化還原輔因子（如NADH）來進行工程代謝是釀酒酵母中的一種有效策略。

2015年，三星先進技術(shù)研究所生物材料實驗室的Gyeonggi－do等人在《Biotechnol． Bioeng．》（IF＝4．260，工程技術(shù)2區(qū)）發(fā)表了題為“Engineering cellular redox balance in Saccharomyces cerevisiae for improved production of L－lactic acid”的文章。在這項研究中，通過刪除胞質(zhì)NADH脫氫酶（NDE1和Nde2）的NADH消耗反應來操縱細胞內(nèi)氧化還原輔助因子，可以有效提高釀酒酵母的L－乳酸產(chǎn)量。

所用到的主要方法

METHODS

1．質(zhì)粒的構(gòu)建

2．不同強度的啟動子的選擇

3．L－乳酸產(chǎn)生菌的構(gòu)建

4．搖瓶發(fā)酵生產(chǎn)L－乳酸

5．補料分批發(fā)酵生產(chǎn)L－乳酸

文章主要內(nèi)容摘要

ABSTRACT

釀酒酵母（Saccharomyces Cerevisiae）是最具特征的真核生物，是最大工業(yè)生物技術(shù)產(chǎn)品生產(chǎn)的首選微生物細胞工廠，并且作為各種化學產(chǎn)品生產(chǎn)強大的、商業(yè)性的、可兼容的工具而被開發(fā)利用。釀酒酵母也被用作乳酸生產(chǎn)的宿主，因其具有很高的耐酸性。本研究通過將細胞代謝通量重定向到L－乳酸的產(chǎn)生，構(gòu)建了L－乳酸高產(chǎn)釀酒酵母（S．cerevisiae）。為此，本研究刪除了編碼丙酮酸脫羧酶1（PDC1）、L－乳酸細胞色素c氧化還原酶（CYB2）和甘油－3－磷酸脫氫酶（GPD1）的釀酒酵母基因，代之以異源L－乳酸脫氫酶（LDH）基因。編碼外源性NADH脫氫酶同工酶的兩個新的靶基因（NDE1和NDE2）也從基因組中刪除，以重新設(shè)計細胞內(nèi)氧化還原平衡。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，構(gòu)建的菌株產(chǎn)生乳酸的效率更高（最終L－乳酸滴度增加了32．6％）。當在生物反應器中以飼料批式模式進行測試時，該工程菌在低pH條件下產(chǎn)生117g／L的L－乳酸。這一結(jié)果表明，應用氧化還原平衡工程應與代謝工程相結(jié)合的技術(shù)，可以有效構(gòu)建L－乳酸高產(chǎn)釀酒酵母。