一種畢赤酵母基因工程表達的光遺傳調(diào)控系統(tǒng)
01
文章背景簡介
BACKGROUND INTRODUCTION
上個世紀，外源化學誘導劑和可溶性轉(zhuǎn)錄因子（TFs）在基因調(diào)控中的應用是促進生物技術(shù)和合成生物學快速發(fā)展的主要動力之一。然而，由于其可逆性有限、誘導劑的轉(zhuǎn)運基于擴散，存在著潛在的脫靶效應、轉(zhuǎn)運延遲和毒性等多種缺陷。
光遺傳調(diào)控具有無創(chuàng)性、可逆性和高時空分辨率等優(yōu)點，有效突破了生化調(diào)控的限制。研究者將光遺傳工具應用于真核細胞的表達調(diào)控。 Yang等人開發(fā)了Lighton和Lightoff系統(tǒng)，報道了一個適用于釀酒酵母的只包含一個單體光敏蛋白LVAD的Ylighton系統(tǒng)。它是Lexa-VVD(LevI)和Gal4蛋白(Gal4AD)激活結(jié)構(gòu)域的融合， 以EL222為基礎(chǔ)構(gòu)建了釀酒酵母光調(diào)控基因表達系統(tǒng)，該系統(tǒng)能產(chǎn)生8.49±0.31g/L異丁醇和2.38±0.06g/L 2-甲基-1丁醇。 Wu等人以EL222為基礎(chǔ)，構(gòu)建了斑馬魚光遺傳表達系統(tǒng)TaEL。Litoralis紅桿菌的光敏蛋白EL222是基于光誘導同二聚反應的系統(tǒng)之一，由222個氨基酸(AA)組成。 EL222的N端為光氧電壓(LOV)結(jié)構(gòu)域，C端為螺旋轉(zhuǎn)螺旋(HTH)結(jié)構(gòu)域。 當EL222受到藍光照射時，黃素單核苷酸(FMN)與LOV的結(jié)合使Jα螺旋偏離LOV，從而釋放HTH，使EL222同二聚并與被稱為克隆1-20 bp(C120)的調(diào)控元件結(jié)合。在黑暗中，F(xiàn)MN與LOV解離。 LOV回到基態(tài)，抑制HTH與DNA的結(jié)合， EL222自發(fā)逆轉(zhuǎn)，導致EL222同聚物迅速解聚和失活。
作為真核生物，畢赤酵母（Pichia pastoris）具有真核表達系統(tǒng)的許多優(yōu)點，如蛋白質(zhì)加工、折疊和翻譯后修飾等。與其他真核表達系統(tǒng)相比，畢赤酵母表達系統(tǒng)具有更快、更簡單、更便宜、表達水平更高的特點。然而，最常用的誘導劑甲醇具有劇毒和易燃的特性，在生產(chǎn)過程中我們很難對甲醇進行監(jiān)測。因此，迫切需要探索一種新的調(diào)控方法。光遺傳調(diào)控可以有效地避免傳統(tǒng)化學誘導劑的缺點，是調(diào)控P.pastoris表達的良好方法。
華中科技大學Zhiqian Wang等人，開發(fā)了一個名為pBctrl的光開關(guān)基因表達系統(tǒng)用于P. pastoris基因工程表達。該系統(tǒng)包括一組專門設計用于匹配P. pastoris中的EL222的光調(diào)節(jié)啟動子。在定制啟動子的幫助下，藍光激活轉(zhuǎn)錄因子VP16-EL222在P. pastoris中起作用。最高感應比達到79.7倍。此外，pBctrl系統(tǒng)被證明對基因表達具有可逆、快速、定量和時空控制。當使用重組脂肪酶作為報告基因時，可以觀察到酶的活性和過表達。這種設計易于在實驗室中實施，并提供了一種新穎、快速、無污染的畢赤酵母表達系統(tǒng)的誘導方法。2022年11月，他們在ACS Synthetic Biology期刊（生物2區(qū) IF 5.25）發(fā)表了“Design and Characterization of an Optogenetic System in Pichia pastoris”，文章詳細描述了該系統(tǒng)的設計、構(gòu)建和表征，并對其應用進行了實驗驗證。該研究為畢赤酵母中基因調(diào)控提供了一種新思路，具有重要的理論和應用價值。
02
所用到的主要方法
METHODS
1、PBCTRL的構(gòu)建
2、倒置熒光顯微鏡觀察
3、共焦熒光成像
4、照明和光學測量
5、酶標儀測量
6、流式細胞術(shù)
7、瓊脂平板顯像
8、脂肪酶活性定量測定
03
文章主要內(nèi)容摘要
ABSTRACT
畢赤酵母（Pichia pastoris）是商品化生產(chǎn)許多有價值蛋白質(zhì)的主要宿主系統(tǒng)。傳統(tǒng)上，畢赤酵母中的基因表達調(diào)控是通過甲醇誘導實現(xiàn)的，但這種方法存在毒性和易燃性等問題。光遺傳技術(shù)提供了一種替代和更清潔的基因調(diào)控方法。本研究利用光敏蛋白EL222設計了一種新型“單組分”光遺傳系統(tǒng)，在藍光下誘導表達，最高誘導比為79.7倍。該系統(tǒng)具有簡單、高效、可重復性好等優(yōu)點，并且可以通過合理設計來進一步改進和擴展其應用。本研究為畢赤酵母中基因調(diào)控提供了一種新思路，具有重要的理論和應用價值。
簡而言之，本文的主要研究內(nèi)容有：
1. 基于 el222的 gs115表達系統(tǒng)的設計
2. 藍光誘導單個細胞集落的激活
3. 劑量依賴性激活
4. 在單細胞水平上評估性能
5. 光開關(guān)空間激活
6. pBctrl 系統(tǒng)的時間行為
7. 重組脂肪酶的表達
原文標題 : 一種畢赤酵母基因工程表達的光遺傳調(diào)控系統(tǒng)
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